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人α干扰素ELISA试剂盒操作说明
阅读次数:1136  发布时间:2012/2/28 17:15:57

                                  α干扰素ELISA试剂盒

本试剂仅供研究使用

试验原理

        IFN-Α试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验(ELISA.已知IFN-Α浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将IFN-Α和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后,加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤,去除未结合的酶结合物,然后加入底物AB,和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中IFN-Α的浓度呈比例关系。
 
试剂盒内容及其配制
试剂盒成份
96孔配置
48孔配置
96/48人份酶标板
1块板(96T
半块板(48T
塑料膜板盖
1
半块
标准品:1000pg/ml
1瓶(1.0ml
1瓶(0.5ml
空白对照
1瓶(1.0ml
1瓶(0.5ml
标准品稀释缓冲液
1瓶(8.0ml
1瓶(4.0ml
生物素标记的抗IFN-Α抗体
1瓶(8.0ml
1瓶(4.0ml
亲和链酶素-HRP
1瓶(12ml
1瓶(5ml
洗涤缓冲液
1瓶(20ml
1瓶(10ml
底物A
1瓶(6.0ml
1瓶(3.0ml
底物B
1瓶(6.0ml
1瓶(3.0ml
终止液
1瓶(6.0ml
1瓶(3.0ml
 
自备材料
1. 蒸馏水。
2. 加样器:5ul10ul50ul100ul200ul500ul1000ul
3. 振荡器及磁力搅拌器等。
4.
 
样品收集、处理及保存方法
 
1、血清……操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原
和内毒素的试管。收集血液后,1000×g离心10分钟将血红
 
细胞迅速小心地分离。
2 血浆……EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。
3 细胞上清液……1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4 组织匀浆……将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟,取上清液。
 5 保存……如果样品不立即使用,应将其分成小部分-70℃保存,避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒,检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
 
α干扰素ELISA试剂盒操作注意事项
 
●   试剂应按标签说明书储存,使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃,不可保存。
●   实验中不用的板条应立即放回包装袋中,密封保存,以免变质。
●   不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
●   使用一次性的吸头以免交叉污染,吸取终止液和底物AB液时,避免使用带金属部分的加样器。
●   使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。
●   底物A应挥发,避免长时间打开盖子。底物B对光敏感,避免长时间暴露于光下。避免用手接触,有毒。实验完成后应立即读取OD值。
●   加入试剂的顺序应一致,以保证所有反应板孔温育的时间一样。
●   按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
 
安全性
 
1.   避免直接接触终止液和底物AB,一旦接触到这些液体,请尽快用水冲洗。
2.   实难中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。
3.   不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。
 
试剂的准备
 
1.   标准品:标准品的系列稀释应在实验时准备,不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。稀释比例按下表中进行:
1000
pg/ml
(6号标准品)
原倍浓度不用稀释直接加入50ul
500
pg/ml
(5号标准品)
100ul的原倍标准品加入100ul的标准品稀释液
250
pg/ml
(4号标准品)
100ul的5号标准品加入100ul的标准品稀释液
125
pg/ml
(3号标准品)
100ul的4号标准品加入100ul的标准品稀释液
62.5
pg/ml
(2号标准品)
100ul的3号标准品加入100ul的标准品稀释液
31.2
pg/ml
(1号标准品)
100ul的2号标准品加入100ul的标准品稀释液
0
pg/ml
(空白对照)
原倍浓度不用稀释直接加入50ul
 
 
2.   洗涤缓冲液(50×)的稀释:蒸馏水50倍稀释。
 
试剂盒性能
 
1.   灵敏度:*小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990
2.   特异性:不与其它细胞因子反应。
3.   重复性:板内、板间变异系数均小于10%
 
α干扰素ELISA试剂盒操作步骤
 
1.   使用前,将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫,以免加样时加入大量的气泡,产生加样上的误差。
2.   根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定,能使用复孔的尽量做复孔。
3.   加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板,轻轻振荡混匀,37温育45分钟。
4.   甩去孔内液体,每孔加满洗涤液,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤,洗涤次数增加一次。
5.   每孔加入100ul的亲和链酶素-HRP,轻轻振荡混匀,37℃温育30分钟。
6.   甩去孔内液体,每孔加满洗涤液,振荡30秒,甩去洗涤液,用吸水纸拍干。重复此操作4次。如果用洗板机洗涤,洗涤次数增加一次。
7.   每孔加入底物A、B各50ul,轻轻振荡混匀,37℃温育5分钟。避免光照。
8.   取出酶标板,迅速加入50ul终止液,加入终止液后应立即测定结果。
9.   450nm波长处测定各孔的OD值。
 
结 果 判 断 与 分 析
 
1、 仪器值:于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD
2、 以吸光度OD值为纵坐标(Y),相应的IFN-Α标准品浓度为横坐标(X),做得相应的曲线,样品的IFN-Α含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度,再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,再乘以稀释倍数,即为样品的实际浓度。
3、 检测值范围: 0-1000pg/ml
4、 敏感度:3.9pg/ml


 

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