冻存技术
1. 液氮法
目前，细胞冻存zui常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢冷冻法冻存细胞。细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成。人elisa试剂盒采用或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，人ELISA试剂盒减少胞内形成冰结晶的机会，从而减少冰晶对细胞的损伤。常用的细胞冷冻贮存器为液氮贮存器，规格有35L3和50L3两种。 细胞冻存时常备的材料有：0.25%胰蛋白酶，含10%～20%的血清培养液，DMSO（分析纯）或无色新鲜（121°C蒸气高压消毒），2mL安瓿（或专用细胞冻存管）、吸管、离心管、喷灯、纱布袋（或冻存管架）等。
主要操作步骤为：
（1）选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天换液。将多个培养瓶中的细胞培养液去掉，用0.25% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心（1000r/min，10分钟）。
（2）去上清液，加入含20%小牛血清的完全培养基，于4℃预冷15分钟后，逐滴加入已无菌的DMSO或，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，细胞浓度为3×106～1×107/mL之间。
（3）将上述细胞分装于安瓿或专用冷冻塑料管中，安瓿装1～1.5mL在火焰喷灯上封口，封口处要完全封闭，圆滑无勾。冷冻管要将盖子盖紧，并标记好细胞名称和冻存日期，同时作好登记（日期、细胞种类及代次、冻存支数）。
（4）将装好细胞的安瓿或冻存管装入沙布袋内；置于液氮容器颈口处存放过夜，次日转入液氮中。采用控制降温速度的方法也可采用下列步骤：先将安瓿置入4℃冰箱中2～3小时，再移至冰箱冷冻室内3～4小时（此步可省略），再吊入液氮容器颈气态部分存放2小时，zui后沉入液氮中。
2. 分布降温法
细胞系冻存程序：
（1）单层细胞的消化。将经24~48小时培养已长成单层的传代细胞培养物弃去生长液，加适量ATV，1~2分钟后倒弃ATV，再加入少量ATV液，经0.5～1分钟倒去ATV，室温或37oC温箱作用2~3分钟，视细胞解离情况，拍打细胞培养瓶。使单层细胞完全解离。SP2／0瘤细胞，待生长好后用吸管吹打，再经1 000转／ 分离心lO分钟。
（2）离心洗涤：向培养瓶内加5~1 0m1预冷的MEM使细胞悬浮，人ELISA试剂盒再将其吸出置灭菌离心管中，以1 000rpm 离心8～10分钟后弃去上清液。
（3）细胞悬液的制备：向离心管内逐滴缓慢加入预冷的冻存保护液，使细胞浓度为150~400万／ml，然后迅速分装于安瓿瓶中，每瓶加量为lml。
（4）致冷冻结：将安瓿瓶放入带有棉垫的纸盒或塑料盒内，直立置不同条件下致冷冻结果保存：
a、4oC两小时后移至一2OoC作用2小时，再移入一4OoC4小时后在一7OoC下24小时投入液氮。
b、一20oC4小时后移致一4OoC。C经4小时移人一7OoC冰箱24小时，投入液氮。
c、一4OoC4小时后移入一70oC24小时后投入液氮。
d、一20oC4小时后移入一70oC经24小时后投入液氮中。
e、一70oC24小时后投入液氮中。
（5）液氮中保存：将冻结后的安瓿装入预冷的小布袋中，投入液氮。为防止安瓿漂浮，可预先在小布袋中加入几块小卵石。
3.玻璃化法
玻璃化保存（Vitrification）是一种超速冷冻方法。它是以极快的速度冷冻细胞，使细胞内外的游离水迅速形成玻璃样物质，而不形成冰晶。人ELISA试剂盒这种保存方法既避免了由于慢速降温时导致的盐浓度升高，又防止了由于冰晶形成造成的物理损伤，可获得较高存活率。玻璃化首先由Luyet在1937年提出，他认为生命是生物活体系统的原子或其他结构元的一种特殊排列．并且轻微的排列位置扰动就会破坏平衡从而导致死亡，而结冰时的驱动力会破坏这种特殊的排列，这就是冰冻死亡的原因。玻璃化比冻结固化方法引起的结构变化要小，因而是一种较理想的低温保存途径。1981年，Fahy首先明确提出，用高浓度的低温保护剂溶液，可在较慢地冷却速率以及高压条件下实现完全的玻璃化，以后又发展了一些所谓“玻璃化溶液”，使细胞、组织乃至器官等范围广泛的生物系统玻璃化低温保存成为可能。1985年，Rail和Fahy[ 目用这种玻璃化溶液使鼠胚胎玻璃化保存获得成功，是这种技术走向实用化的突破。
复苏技术
1.细胞复苏的原则
在实际操作中，冻存细胞要进行复苏，再培养传代。复苏细胞一般采用快速融化法。以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。
2.细胞复苏的主要操作步骤
（1）佩戴眼镜和手套，从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。
（2）迅速放入38℃水浴中，并不时摇动，在1分钟内使其完全融化，然后在无菌下取出细胞。
（3）在1000r/min速度下离心5～10分钟，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度1×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换一次培养液，继续培养，观察生长情况。若细胞密度较高，及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中，并加入培养基贴壁培养12～24小时后，充去上清，换入新鲜培养基继续培养。
3.注意事项
在细胞复苏操作时，应注意融化冻存细胞速度要快，人ELISA试剂盒可不时摇动安瓿或冷冻管，使之尽快通过zui易受损的温度段（-5～0℃）。这样复苏的冻存细胞存活率高，生长及形态良好。然而，由于冻存的细胞还受其他因素的影响，有时也会有部分细胞死亡。人ELISA试剂盒此时，可将不贴壁、飘浮在培养液上（已死亡）的细胞轻轻倒掉，再补以适量的新培养液，也会获得较为满意的结果。
原创作者：上海恒远生物技术发展有限公司
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