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技术文章

ELISA技术综述(二)

点击次数:12935   发布时间:2023/5/15 16:37:18

 
ELISA的商品化试剂盒成分和分类:
 
在临床检验或者科研检测中,ELISA 实验通常有商品试剂盒提供。ELISA试剂盒中有三个必要的试剂:免疫吸附剂、结合物和酶的底物等。
 
完整的ELISA试剂盒包含以下各组分:(1)已包被抗原或抗体的固相载体(免疫吸附剂);
(2)酶标记的抗原或抗体(结合物);
(3)酶的底物;
(4)阴性对照品和阳性对照品(定性测定中),参考标准品和控制血清(定量测定中);
(5)酶联物(结合物)及标本的稀释液;
(6)洗涤液;
(7)酶反应终止液。
 
1、免疫吸附剂
 
已包被抗原或抗体的固相载体在低温(2~8℃)干燥的条件下一般可保存6个月以上。有些不完整的试盒,仅供应包被用抗原或抗体,检测人员需自行包被。如BioTNT 网站中,代理的产品,有的是complete的试剂盒,有的是需要再进行包被的duoset,或者是其他的说法,都是不完整的试剂盒。
 
1.1 固相载体
 
固相载体在ELISA测定过程中作为吸附剂和容器,不参与化学反应。可作ELISA中载体的材料很多,常用的是聚苯乙烯。聚苯 乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能,抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性,加之它的价格低廉,所以被普遍采用。聚苯乙烯为塑料,可制成各种形式。
 
ELISA载体的形状主要有三种:微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板为常用,用于EILSA的产品称为ELISA板,上标 准的微量滴定板为8×12的96孔式。为便于作少量标本的检测,有制成8联孔条或12联孔条的,放入座架后,大小与标准ELISA板相同。ELISA板的 特点是可以同时进行大量标本的检测,并可在特制的比色计上迅速读出结果。现在已有多种自动化仪器用于微量滴定板型的ELISA检测,包括加样、洗涤、保 温、比色等步骤,对操作的标准化为有利。聚苯乙烯经射线照射后,其吸附性能特别是对免疫球蛋白的吸附性能增加,应用于双抗体夹心法可使固相上抗体量增 多,但用于间接法测抗体时空白值较大。
 
良好的ELISA板应该是吸附性能好,空白值低,孔底透明度高,各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔 之间性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工艺的差别,各种产品的质量差异很大,因此,每一批号的ELISA板在使用须事先检查其性能。 常用的检查方法为:以一定浓度的人IgG(一般为10ng/ml)包被ELISA板各孔,洗涤后每孔内加入适当稀释度的酶标抗人IgG抗体,保温后洗涤, 加底物显色,终止酶反应后,分别测每孔溶液的吸光度。控制反应条件,使各孔读数在吸光度0.8左右。计算全部读数的平均值。所有单个读数与全部读数的均数 之差,应小于10%。
与聚苯乙烯类似的塑料是聚氯乙烯。作为ELISA固相载体,聚氯乙烯的特点为质软板薄,可剪割,价廉,但光洁度不如聚苯乙烯板,孔底亦不如聚苯乙烯平整。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高,但空白值也略高。
 
为比较不同固相在某一ELISA测定中的优劣,可应用如下的试验:用其他免疫学测定方法选出一个典型的阳性标本和阴性标本,将它们进行一系列稀释后,在 不同的固相载体上按预定的ELISA操作步骤进行测定,然后比较结果。在哪一种载体上阳性结果与阴性结果差别大,这种载体就是这一ELISA测定项目的 合适的固相载体。
 
在ELISA中,用作固相载体的小珠一般为直径0.6cm的圆珠,表面经磨砂处理后吸附面积大大增加。ELISA板孔的吸 附面积约为200mm2,小珠均为1000mm2,将近ELISA板孔的5倍。吸附面积的增大即意味着固相抗原或抗体量的增加。再者,球型小珠的表面弧度 更有利于吸附的抗原决定簇或抗体结合位点的暴露面处于佳反应状态,因此珠式ELISA的反应往往更为灵敏。小珠的另一特点是更易于使洗涤彻底,使用特殊 的洗涤器,使小珠在洗涤过程中滚动淋洗,其洗涤效果远较板孔的浸泡式为好。但由于磨砂工艺的难度较大,小珠的均一性较差。
 
小试管作为固相载体也有较大的吸附表面,而且标本的反应量也相应增加。板式及珠式ELISA的标本量一般为00-200ul,而小试管可根据需要加大反应体积,标本反应量的增加有助于试验敏感性的提高。小试管还可以当作比色杯,后直接放入分光光度计中比色。
 
也有应用聚苯乙烯胶乳或其他材料制成的微粒作为ELISA固相载体的。其优点是表面积大,反应在悬液中进行,其速率与液相反应近似。以含铁的磁性微粒作为ELISA固相载体,反应后用磁铁的吸引进行分离,洗涤方便,试剂盒一般均配以特殊仪器。
 
应用于科研域,定量检测的试剂盒,对固相载体的要求比较高,一般采用nunc 或者costar,或者其他知名品牌的酶标板,来进行包被。

原创作者:上海恒远生物技术发展有限公司

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